Soroconversão após a vacinação autógena contra mastite em vacas leiteiras mestiças

Ana Cláudia Fagundes Faria¹ · Carla Cristian Campos² · Paulo César Franco Dutra² · Felipe Zanforlin Freitas³ · Roberta Tomaz Botta França¹‧² · Isabela Pacheco Borges² · José William Maluf de Paula² · Ricarda Maria dos Santos¹ Introdução

A mastite bovina é uma doença que causa grandes perdas econômicas em fazendas leiteiras devido aos custos com tratamento, à redução da qualidade do leite, ao descarte tanto de leite com resíduos de antimicrobianos quanto de animais (De Vliegher et al. 2012). Estratégias de controle e prevenção da mastite são essenciais para reduzir os impactos negativos dessa doença. A prevenção da mastite por meio da vacinação pode ser mais eficiente e menos dispendiosa do que o tratamento após a infecção, já que há uma redução da pressão de infecção, da severidade dos quadros clínicos e do uso de antimicrobianos (Kurtyak et al. 2021).

As vacinas autógenas têm ganhado importância crescente ao longo dos anos, especialmente devido aos esforços para reduzir o uso dos antimicrobianos (Grein et al. 2022). As bacterinas utilizadas na fabricação das vacinas autógenas são originadas de cepas bacterianas que circulam e causam mastite em um determinado rebanho leiteiro. Desta forma, os antígenos são mais específicos nas vacinas autógenas quando comparadas às vacinas comerciais.

O objetivo deste estudo foi avaliar a soroconversão de anticorpos específicos (imunoglobulinas - IgG) após a vacinação autógena contra mastite em vacas leiteiras mestiças.

Materiais e métodos

O experimento foi conduzido em uma fazenda leiteira comercial localizada na região do Triângulo Mineiro, no estado de Minas Gerais, Brasil. O rebanho era composto por animais da raça Girolando (1/2 a 7/8 cruzado Holandês x Gir), com cerca de 1085 vacas em lactação, produzindo em média 30,3 kg de leite/vaca/dia. As vacas eram alojadas em sistema de Compost Barn com cama de serragem, com resfriamento na linha de cocho e na sala de espera da ordenha. As vacas em lactação eram divididas em lotes de acordo com a produção de leite. A dieta total era fornecida três vezes ao dia, composta por silagem de milho, concentrado e minerais, formulada de acordo com as recomendações do National Research Council (2001) e com acesso ad libitum à água.

As vacas em lactação eram ordenhadas mecanicamente três vezes ao dia (4 h da manhã, meio-dia e 8 h da noite) por quatro ordenhadores. A máquina de ordenha é do tipo linha média com 24 conjuntos e teteiras de silicone com extração automática. A manutenção preventiva era realizada a cada quatro meses e as teteiras substituídas a cada 5000 ordenhas. A rotina de ordenha consistia no teste de caneca em todos os tetos, pré-dipping com peróxido de hidrogênio (Prima^®, DeLaval), secagem dos tetos com papel toalha descartável (pelo menos uma folha por teto) e pós-dipping com iodo (Della Barrier^®, DeLaval). O protocolo de secagem iniciava com a retirada completa do leite, seguida pela aplicação do antimicrobiano intramamário (cefalosporina ou penicilina associada a aminoglicosídeo) e injeção do selante em cada teto.

O diagnóstico de mastite clínica foi realizado por meio do teste de caneca em todos os tetos a cada ordenha, para detectar leite anormal (presença de grumos e/ou quaisquer alterações na coloração e na consistência) e sinais de inflamação do quarto mamário. Uma amostra de leite era coletada de cada caso para cultura microbiológica na fazenda. Amostras individuais de leite eram coletadas mensalmente nos medidores de leite para diagnóstico de mastite subclínica por meio da contagem de células somáticas (CCS), utilizando o limite de 200.000 células/ml de leite para definição das vacas infectadas. Os parâmetros de qualidade do leite da fazenda foram de 318.000 células de média de CCS de tanque e 9,4% de incidência mensal de mastite clínica durante o período experimental.

A primeira etapa da fabricação da vacina autógena foi a identificação do perfil microbiológico da mastite na fazenda. Para isso, todas as vacas do rebanho foram submetidas ao California Mastitis Test (CMT). Durante o teste, qualquer grau de reatividade foi considerado, e 429 amostras de leite foram coletadas para cultura microbiológica, conforme Adkins (2017). No laboratório comercial, as amostras de leite foram semeadas usando alças bacteriológicas descartáveis em placas de Petri bipartidas contendo ágar sangue e ágar cromogênico, ambos não seletivos. As placas foram incubadas a 37°C por 48 h e a leitura foi realizada para identificação das colônias suspeitas de acordo com suas características em ambos os meios de cultura. Posteriormente, colônias de interesse foram repicadas em ágar-sangue, cromogênico, manitol (suspeita de Staphylococcus spp.) e MacConkey (suspeita de Klebsiella spp.), e as placas foram incubadas novamente a 37°C por 24 h. Após esse período, alguns testes como catalase, oxidase, coloração de Gram, entre outros testes bioquímicos foram realizados para confirmar as suspeitas. Para algumas bactérias, a reação em cadeia de polimerase (PCR) foi utilizada como teste confirmatório, quando os testes bioquímicos apresentavam resultados variáveis. As taxas de isolamento obtidas estão descritas na Tabela 1.

Tabela 1. Taxa de isolamento bacteriano de amostras de leite coletadas após teste CMT.

Espécie bacteriana	Taxa de isolamento (n)
Cultura negativa	60.1% (258)
Staphylococcus não aureus (SNA)	11.7% (50)
Corynebacterium bovis	6.5% (28)
Streptococcus uberis	5.4% (23)
Streptococcus agalactiae	4.2% (18)
Escherichia coli	4.0% (17)
Amostras contaminadas	1.9% (8)
Bacillus spp.	1.6% (7)
Klebsiella spp.	1.6% (7)
Streptococcus dysgalactiae	1.2% (5)
Mais de uma bactéria	1.2% (5)
Staphylococcus aureus	0.5% (2)
Lactococcus spp.	0.2% (1)

¹Amostras de leite com ≥4 espécies bacterianas; ²Mais de uma espécie bacteriana na amostra da mesma vaca.

Cada espécie bacteriana isolada e identificada a partir das amostras de leite foi utilizada para produzir uma semente, a qual posteriormente foi usada na fabricação da vacina autógena. Os critérios adotados para seleção das espécies para inclusão na vacina foram a taxa de isolamento e o histórico da cultura microbiológica feita na fazenda dos casos clínicos de mastite. As espécies mais prevalentes nas culturas realizadas na fazenda foram Streptococcus agalactiae e Staphylococcus não aureus, diferenciado em Staphylococcus chromogenes. Assim, as sementes de S. chromogenes, Corynebacterium bovis, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae e Escherichia coli foram selecionadas para a composição da vacina autógena.

A segunda etapa foi o envio da solicitação de fabricação ao Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA Brasil), conforme determinado pelo Regulamento Técnico para Produção, Controle e Uso de Vacinas Autógenas (Instrução Normativa nº 31, de 20 de maio de 2003). Após a autorização, que leva cerca de três dias, a produção da vacina foi inciada na fábrica da Inata Biológicos, localizada em Uberlândia, Brasil.

Para produzir a vacina autógena, todas as espécies bacterianas selecionadas foram cultivadas individualmente em caldo triptona de soja modificado a 37°C sob agitação de 200 rpm por 48 h. O meio de cultura foi centrifugado a 3.500 xg por 20 minutos e o pellet bacteriano foi lavado três vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). As bactérias foram suspensas em uma solução de formalina a 1% em PBS (10⁸ unidades formadoras de colônias (UFC)/mL), e a suspensão foi agitada lentamente por 48 h a 25°C. As células bacterianas completamente inativadas foram lavadas três vezes com PBS estéril para remoção da formalina. O adjuvante comercial Montanide™ ISA 61 (Seppic, Paris, França) foi emulsificado com as bactérias inativadas em uma proporção volumétrica de 26% de antígeno e 74% de adjuvante como concentração final.

Sessenta vacas mestiças em lactação foram pareadas com base na similaridade dos dias em lactação (DEL), número de partos, CCS e produção de leite (Tabela 2). Uma vaca de cada par foi aleatoriamente designada para o grupo Vacinado (n = 30) e a outra vaca para o grupo Controle (n = 30).

Tabela 2. Comparação estatística dos parâmetros descritivos de vacas leiteiras em dois grupos experimentais.

Variável	Vacinado	Controle	P-valor
Número de animais	30	30
Dias em lactação	43,7 ± 8,95	40,7 ± 6,75	0,148
Produção de leite (kg/dia)	36,01 ± 10,15	33,43 ± 8,30	0,286
Paridade	2,00 ± 0,947	2,17 ± 0,834	0,472
Contagem de células somáticas*	74,1 ± 87,8	82,2 ± 93,8	0,729
Taxa de mastite subclínica (%)	10	10

(* x1.000 células/ml de leite)

O protocolo vacinal foi iniciado em março de 2022, que consistia em uma aplicação intramuscular de uma dose (2 ml) da vacina autógena, A segunda dose (reforço) foi administrada 30 dias após a primeira. O grupo Controle recebeu 2 ml de solução salina estéril (placebo) também pela via intramuscular, seguindo o mesmo protocolo do grupo Vacinado.

Amostras de sangue de todas as vacas foram coletadas para a análise de soroconversão. As coletas se iniciaram no dia da primeira aplicação (março - D0), no dia do reforço (abril - D30), seguindo nos próximos três meses após o reforço (maio - D60, junho - D90 e julho - D120).

A soroconversão de anticorpos específicos do tipo IgG das vacas durante o período de imunização foi avaliada por meio do ensaio imunoenzimático (ELISA). As amostras foram analisadas individualmente e em seguida o resultado foi calculado pela média do grupo para cada dia de coleta. Microplacas de poliestireno de 96 poços de alta afinidade (Corning Costar® 3590, Corning Incorporated, EUA) foram individualmente recobertas com as cepas isoladas de S. uberis, S. agalactie, S. dysgalactiae, S. chromogenes, C. bovis e E. coli em tampão carbonato-bicarbonato (0,06 M, pH 9,6) e incubado durante a noite a 4°C. Após a lavagem dos poços com PBS contendo 0,05% Tween 20 (PBS-T), albumina sérica bovina em PBS-T (5% PBS-T-BSA) foi adicionada como solução bloqueadora.  A placa foi incubada por 1h a 37°C. Amostras de soro das vacas com IgG (1:500) foram diluídas em PBS-T-BSA 3% e incubadas por 1h a 37°C. Após a lavagem com PBS-T, o anticorpo secundário anti-IgG bovino, produzido em cabra e conjugado à peroxidase, foi diluído na proporção de 1:15,000 em solução de PBS-T-BSA a 1% e incubado por 1 hora a 37 °C. Após a lavagem, a reação foi desenvolvida pela adição de solução de TMB por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 100 μL de solução de parada. A densidade óptica (DO) foi determinada a 600 nm em um leitor de ELISA. Os dados foram expressos como índice ELISA (IE), sendo IE = DO/ponto de corte dos controles negativos acrescidos de três desvios-padrão. Para estabelecer os valores de ponto de corte para os controles negativos de IgG, foi utilizado soro de vacas não vacinadas (grupo Controle). Valores de IE > 1,2 foram considerados positivos.

Para a análise da soroconversão por ELISA, as amostras foram analisadas em triplicata e o resultado expresso em IE, Diferenças significativas foram determinadas pelo Teste t com comparações múltiplas pelo teste Bonferroni utilizando o software Graph­Pad Prism (versão 6,01), Significância estatística foi definida como P ≤ 0,05,

Resultados e discussão

A vacina autógena contra mastite foi capaz de estimular o sistema imunológico das vacas do grupo Vacinado a produzir anticorpos específicos contra as espécies bacterianas presentes na vacina. Nas amostras de sangue coletadas no D0, não houve diferença significativa nos níveis de IgG detectados entre os grupos Vacinado e Controle. Já nos dias D30, D60, D90 e D120 após a vacinação, houve diferença significativa (P < 0,05) no IE entre os grupos Vacinado e Controle, que variou de acordo com cada espécie bacteriana testada (Figura 1). Um aumento nos níveis de anticorpos no D30 foi observado apenas para C. bovis, S. agalactiae e S. uberis, mas esse efeito não verificado para as espécies de E. coli, S. chromogenes e S. dysgalactiae.

Figura 1: Soroconversão detectada por ensaio imunoenzimático (ELISA) para o grupo controle (•) e para o grupo vacinado para as seguintes bactérias: Corynebacterium bovis (■), Escherichia coli (○), Staphylococcus chromogenes (▲), Streptococcus agalactiae (♦), Streptococcus dysgalactiae (*) e Streptococcus uberis (x), nos dias 0, 30, 60, 90 e 120 após a aplicação da primeira dose da vacina autógena. A linha pontilhada vermelha representa o limiar do índice ELISA (IE).

Resultado semelhante foi encontrado por Piepers et al, (2017), no qual os animais vacinados com uma vacina comercial polivalente demonstraram uma maior concentração de anticorpos específicos comparados com animais não vacinados. No entanto, Wilson et al., (2009) verificaram níveis elevados de IgG após a vacinação com a cepa mutante de E, coli O111:B4 (J5) usando uma vacina comercial, comparando vacas vacinadas e não vacinadas, e nos períodos seco e pós-parto. Com a revacinação (dose de reforço) anticorpos são rapidamente produzidos e em maiores quantidades, além de permanecerem por mais tempo, e a atividade fagocítica dos neutrófilos parece aumentar, desencadeando uma eliminação mais eficiente da infecção (Mohyuddin et al., 2020; Piepers et al., 2017).

O experimento foi conduzido em uma fazenda leiteira comercial e o rebanho estava sob risco de mastite devido à alguns desafios. Durante o período do estudo, o intervalo entre as ordenhas estava muito curto (menos de uma hora) por causa do número de vacas em lactação exceder a capacidade da máquina de ordenha. Além disso, a densidade animal nos barracões também era elevada, o que comprometia a qualidade da cama. No entanto, apesar desses desafios, a soroconversão após a vacinação foi evidente.

Referências

Adkins, PRF (2017) Laboratory handbook on bovine mastitis. 3^rd edition. National Mastitis Council, New Prague.

De Vliegher S, Fox LK, Piepers S, McDougall S, Barkema HW (2012) Invited review: Mastitis in dairy heifers: Nature of the disease, potential impact, prevention, and control. J Dairy Sci 95(3):1025–1040. https://doi.org/10.3168/jds.2010-4074

Grein K, Jungbäck C, Kubiak V (2022) Autogenous vaccines: quality of production and movement in a common market. Biologicals 76:36–41. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2022.01.003

Kurtyak BM, Boyko PK, Boyko, OP, Sobko GV, Romanovych MS, Pundyak TO, Mandygra YM, Gutyj BV (2021) Autogenous vaccines are an effective means of controlling the epizootic process of mastitis in cows. Ukr J Ecol 11(3):145–152. https://doi.org/10.15421/2021_157 

Mohyuddin MT, Muhammad G, Deeba F, Arshad, MI (2020) Therapeutic evaluation of autogenous mastitis vaccine alone and in combination with routine therapy in subclinical mastitis. Pak J Agri Sci 57(4):957–961. https://doi.org/10.21162/PAKJAS/20.9040 

National Research Council (2001) Nutrient requirements of dairy cattle. National Academies Press, Washington.

Piepers S, Prenafeta A, Verbeke J, De Visscher A, March R, De Vliegher S (2017) Immune response after an experimental intramammary challenge with killed Staphylococcus aureus in cows and heifers vaccinated and not vaccinated with Startvac, a polyvalent mastitis vaccine. J Dairy Sci 100(1):769–782. https://doi.org/10.3168/jds.2016-11269

Wilson DJ, Mallard BA, Burton JL, Schukken YH, Grohn Y (2009) Association of Escherichia coli J5-specific serum antibody responses with clinical mastitis outcome for J5 vaccinate and control dairy cattle. Clin Vaccine Immunol 16(2):209–217. https://doi.org/10.1128/CVI.00324-08